Identifikasi L. casie dengan Metode Pewarnaan Gram

      Pewarnaam bakteri dapat dibedakan atas tiga golongan, yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan khusus. Metode pewarnaan gram merupakan jenis pewarnaan diferensial. Pewarnaan ini memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu gram positif dan gram negatif. Metode pewarnaan gram merupakan metode dapat yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri gram positif dan gram negatif dengan menggunakan zat warna sebagai pembeda.

Apa itu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif ?

Bakteri gram positif merupakan jenis bakteri dengan dinding peptidoglikan yang tebal, sementara bakteri gram negatif adalah jenis bakteri dengan dinding peptidoglikan yang tipis. Perbedaan ketebalan dinding ini mengakibatkan perbedaan kemampuan aktifitas dengan pewarnaan gram. Bakteri gram positif dapat mempertahankan zat warna metil ungu. Sedangkan bakteri gram negatif tidak dapat mempertahankan zat warna metil ungu karena ikut tercuci  saat perlakuan dengan alkohol. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna tandingan (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah. Pengujian ini berguna untuk membedakan kedua tipe bakteri yang didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.

Bagaimana pengaruh perbedaan struktur dinding sel bakteri terhada pengikatan zat warna?

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel berupa lipoposakarida (lipid) yang dapat larut oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna ungu.

Bagaimana penggunaan zat warna dalam metode pewarnaan gram ?

          Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganise yang bersifat asam, baik bakteri gram positif maupun gram negatif sehingga sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna ungu.

          Iodin merupakan larutan yang berfungsi untuk memperkuat pengikatan warna primer oleh bakteri. Iodin tersusun atas iodium, kalium iodida dan aquades. Iodin dapat memperkuat warna pada bakteri karena dapat membentuk persenyawaan kompleks kristal violet-yodium.

          Alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna primer pada sel bakteri (mikroorganisme). Alkohol tersusun atas etanol dan air dengan konsentrasi tertentu. Mekanisme alkohol dalam pewarnaan gram berperan dalam proses dekolorisasi karena perbedaan komponen dinding sel bakteri. Dinding sel bakteri gram negatif sebagian besar tersusun atas lipid dan dinding selnya tipis. Lipid dapat larut dalam alkohol. Sehingga pemberian alkohol pada bakteri gram negatif akan melarutkan lipid yang akan memperbesar permeabilitas dinding sel. Hal tersebut menyebabkan bakteri gram negatif melepaskan zat warna primer.

          Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Zat-zat warna pada safranin dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri, karena pori-pori pada dinding sel bakteri khususnya bakteri gram negatif tidak dapat tertutup rapat setelah perlakuan dengan alkohol.

Bagaimana hasil identifikasi Lactobacillus casei ?

          Mikroba jenis Lactobacillus casei yang diidentifikasi menunjukkan bahwa Lactobacillus casei dapat mempertahankan warna ungu kristal violet dan berbentuk kokus atau batang saat diamati menggunakan mikroskop. Hasil pengamatan tersebut mengindikasikan bahwa Lactobacillus casei merupakan bakteri gram positif.

Isolasi Lactobacillus casei

       Isolasi adalah suatu kegiatan memindahkan biakan mikroorganisme dari media yang lama ke media baru. Prinsip  isolasi yaitu memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapatkan kultur murni. Kultur murni merupakan biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu spesies atau satu jenis mikroba. Isolasi bertujuan untuk memisahkan mikroorganisme dari campurannya dan meremajakan kultur ke dalam media baru.

Bagaimana cara mendapatkan kultur murni ?

          Caranya, dalam suatu media yang telah ditumbuhi berbagai jenis mikroba sebagai hasil dari proses inokulasi kita melakukan pengamatan dengan cermat terhadap koloni mikroba tersebut. Adapun koloni mikroba yang akan diisolasi atau dipindahkan adalah koloni yang memenuhi ciri-ciri mikroba yang diinginkan. Hal yang harus digaribawahi adalah kita hanya boleh memindahkan mikroba yang berasal dari satu koloni saja, karena jika berbeda koloni dikhawatirkan akan bercampur dengan mikroba lain yang tidak diinginkan.

          Lactobacillus adalah bakteri yang dapat memecah protein, karbohidrat, dan lemak dalam makanan. Lactobacillus casei merupakan Bakteri Asam Laktat (BAL) karena dalam proses fermentasi dapat menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir. Sehingga bakteri ini banyak digunakan dalam minuman probiotik seperti yakult yang dapat menjaga kesehatan usus. Lactobacillus casei berbentuk batang atau basi, tidak berspora, tidak motil, dan merupakan bakteri gram positif.

          Lactobacillus casei dapat ditumbuhkan pada media NA (Nutrient Agar) dan media MRS (deMann Rogosa Sharpe). Media NA merupakan media yang baik untuk menumbuhkan mikroorganisme jenis bakteri. Media MRS adalah suatu media pertumbuhan mikroba yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri Lactobacillus. Media MRS dikembangkan oleh J.C. deMan, M. Rogosa, dan M. Elisabeth Sharpe. MRS dikembangkan untuk menggantikan media yang menggunakan sari tomat dan sari buah tomat ekstrak daging. Media ini sangat baik untuk pertumbuhan Lactobacililus. Bakteri lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Pediococcus dan Leuconostoc. Media MRS mengandung polisorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui sebagai faktor penumbuh Lactobacililus.

Apakah alat yang digunakan untuk mengisolasi mikroba ?

          Ada berbagai macam alat yang dibutuhkan dalam proses inokulasi, namun yang paling berperan penting ialah jarum ose. Jarum ose adalah alat bantu dalam kegiatan mengisolasi biakan mikroorganisme untuk ditanam atau ditumbuhkan ke media baru. Jarum ose biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum ose dapat berbentuk lingkaran (loop) yang disebut ose bundar atau inoculating loop, dan yang berbentuk lurus disebut ose tusuk/lurus atau inoculating needle. Ose bundar cocok untuk melakukan penggoresan (streak) di permukaan agar, sedangkan ose tusuk cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak.

Apa saja metode isolasi ?

          Isolasi dapat dilakukan dengan metode gores dan metode tusuk. Metode gores terdiri atas goresan kuadran, goresan radian, goresan zig-zag/sinambung, dan togesan T. Metode tusuk biasanya dilakukan pada media agar tegak sedangkan metode goresan zig-zag dilakukan pada media agar miring. Selain itu, metode goresan zig-zag dan metode goresan lainnya yang telah disebutkan di atas dapat dilakukan pada media di cawan petri.

Bagaimana hasil isolasi Lactobacillus casei?

          Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa mikroorganisme tumbuh lebih baik pada media MRS agar, sebab hasil pengamatan pertumbuhan mikrooganisme pada media MRS agar lebih banyak daripada media NA. Selain itu, pada koloni tunggal yang terpisah dari koloni lainnya dapat diamati bahwa koloni pada media agar berukuran 2-5 mm, berbentuk bulat, cembung dan berwarna putih susu atau krem. Ciri-ciri tersebut mempunyai kemiripan dengan ciri yang dimiliki oleh mikroba Lactobacillus casei. Sehingga kemungkinan mikroba yang diisolasi adalah Lactobacillus casei.

Perhitungan Jumlah Rhizopus Stolonifer

Perhitungan jumlah mikroba adalah suatu kegiatan untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan atau sampel. Perhitungan jumlah mikroba bertujuan untuk menghitung jumlah sel dari suatu kultur mikroba secara kuantitatif. Pertumbuhan mikroorganisme dapat diukur berdasarkan jumlah sel mikroba yang tumbuh pada media.

Mengapa jumlah mikroba perlu dihitung ?

          Karena pada suatu bahan pangan, kualitasnya ditentukan oleh jumlah mikroba yang terkandung didalamnya. Mikroba tersebut ada yang bersifat menguntungkan dan merugikan.  Sehingga dengan melakukan perhitungan jumlah mikroba kita dapat mengetahui secara kuantitatif apakah makanan tersebut layak dikonsumsi atau tidak. Selain itu, kita juga dapat melakukan suatu upaya untuk menekan pertumbuhan mikroba yang merugikan dan membantu pertumbuhan mikro yang mengungtungkan.

          Proses perhitungan sel mikroba dapat dilakukan dengan  metode langsung (direct method) maupun tidak langsung (indirect method). Perhitungan secara langsung yaitu menghitung jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang hidup atau yang mati. Salah satu cara enumerasi secara langsung yaitu dilakukan dengan membuat preparat dari suatu sampel yang menggunakan ruang hitung (counting camber). Enumerasi secara tidak langsung yaitu hanya menghitung jumlah mikroba yang hidup. Metode ini dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu metode hitung pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melalui pengenceran, serta perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN method).

Metode perhitungan jumlah mikroba yang dijelaskan pada postingan ini adalah metode hitung pada cawan petri (total plate count/TPC). Total Plate Count (TPC) adalah metode yang dapat menghitung sel yang masih hidup dengan anggapan bahwa setiap sel yang hidup akan berkembang menjadi satu satu koloni. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu dapat dihitung sebagai satu koloni. Prosedur perhitungan mikroba metode TPC dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 4 kuadran lalu menghitung jumlah koloni mikroba pada salah satu kuadran, dimana satu kuadran mewakili semua kuadran dan memenuhi syarat Standard Plate Count (SPC) yaitu 30-300 koloni mikroba.

Cawan Petri dibadi menjadi 4 kuadran

Batasan terkecil untuk menghitung jumlah suatu mikroba adalah 30 koloni. Suatu hasil perhitungan mikroba yang kurang dari 30 koloni akan dikategorikan Terlalu Sedikit untuk Dihitung (TSUD). Apabila melewati batas perhitungan yaitu diatas 300 koloni, maka dikategorikan ke dalam Terlalu Banyak untuk Dihitung (TBUD).

Hasil perhitungan jumlah mikroba pada bahan roti berjamur dengan metode spread plate adalah 43 koloni. Sedangkan pada metode pour plate hasil perhitungan yang diperoleh 31 koloni. Hasil memenuhi standar yang ditetapkan dalam SPC, namun mendekati kategori Terlalu Sedikit Untuk Dihitung (STUD).

Terjadinya TSUD tersebut dapat disebabkan oleh faktor pengenceran pada proses inokulasi sebelumnya dan suhu pada saat inkubasi. Jika pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi, dapat menyebabkan hasil perhitungan menjadi TSUD sedangkan pengenceran yang terlalu rendah menyebabkan hasil perhitungan menjadi TBUD. Proses inkubasi dilakukan pada suhu 37°C, sementara suhu optimum pertumbuhan Rhizopus stolonifer adalah 25°C. Sehingga hal ini menyebabkan Rhizopus stolonifer tidak dapat tumbuh dengan baik.

Inokulasi Miroba pada Roti

          Roti merupakan salah satu makanan praktis yang banyak digunakan sebagai menu sarapan pagi sebagian masyarakat Indonesia. Roti dapat dibuat berbagai macam bentuk dan rasa sesuai dengan keinginan pembuatnya dan keinginan konsumen. Namun, terkadang kita menemukan roti yang sudah rusak karena ditumbuhi jamur.

Mengapa bisa ?

          Karena roti terbuat dari tepung terigu yang diragikan. Jadi, roti  mengandung pati dalam jumlah yang relatif tinggi dimana  pati tersebut dapat dihidrolisis menjadi gula sederhana yang  merupakan sumber nutrisi utama bagi  jamur. Pembusukan roti disebabkan oleh rusaknya protein dan pati. Secara langsung pembusukan roti disebabkan oleh mikroorganisme pembusuk seperti kapang. Kapang yang paling sering ditemukan dalam roti adalah Rhizopus stolonifer. Ciri-ciri Rhizopus stolonifer tumbuh dengan cara memperpanjang hifa yang bercabang pada ujungnya. Hifa yang bercabang tersebut disebut miselium yang berfungsi sebagai akar rizoid. Selain itu, terdapat pula stolon dan sporangium sebagai penghasil spora.  Suhu pertumbuhan Rhizopus stolonifer yaitu 5°C – 37°C, namun pertumbuhan optimum dicapai pada suhu 25°C.

          Inokulasi atau penanaman mikroba adalah kegiatan memindahkan mikroorganisme dari sumber asalnya atau lingkungannya ke medium baru melalui pencampuran nutrisi-nutrisi tertentu yang telah disesuaikan dengan nutrisi optimum pertumbuhan mikroba. Inokulasi dilakukan dengan cara aseptis untuk menghindari kontaminasi dari mikroba yang tidak diinginkan. Inokulasi dimaksudkan untuk menumbuhkan, meremajakan mikroba dan mendapatkan populasi mikroba yang diinginkan.

          Kali ini mikroba yang akan ditanam atau diinokulasi adalah  jenis Rhizopus stolonifer yang bersumber dari roti yang telah ditumbuhi jamur. Prosesnya diawali dengan melakukan pengenceran terhadap roti tersebut.

Bagaimana caranya ?

          Caranya dengan menggunakan larutan fisiologis sebagai pelarutnya. Larutan fisiologis yang umum digunakan adalah campuran NaCl dan aquades pada konsentrasi 0,85%. Larutan fisiologis bersifat isotonis sehingga mampu menjaga tekanan osmosis di dalam dan di luar sel. Tekanan osmosis yang seimbang tersebut dapat mencegah terjadinya lisis terhadap sel mikroba yang diencerkan. Selain itu, larutan fisiologis biasanya mengandung buffer yang berupa fosfat. Fosfat merupakan komponen anorganik yang mempunyai kisaran pH normal sehingga mampu menjaga keseimbangan ion pada mikroba. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat dengan menggunakan larutan fisiologis 0,85% sebagai pelarutnya.  Pada proses inokulasi, pengenceran bertingkat dilakukan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang akan ditanam sehingga didapatkan koloni yang terpisah dan tidak terjadi penumpukkan pada media. Jadi, bahan roti berjamur diencerkan sebanyak 3 kali dengan perbandingan 1 : 9 terhadap larutan fisiologis, artinya 1 ml suspensi bahan yang dipipet ditambahkan ke dalam 9 ml larutan fisiologis.

          Setelah diencerkan, maka suspensi bahan roti tersebut dapat ditanam pada media di cawan petri. Kali ini kita menggunakan media jenis PCA (Plate Count Agar). Penanaman dapat dilakukan dengan 2 metode yaitu:

Ø  Penanaman Mikroba Metode Tuang (Pour Plate)

Metode tuang atau pour plate merupakan salah satu metode inokulasi dengan dengan cara menuang suspensi mikroba terlebih dahulu kemudian dituang media agar di atas dan dibiarkan memadat. Metode pour plate menyebabkan suspensi mikroba dapat tumbuh di atas permukaan agar dan terendam di dalam agar. KeadaanZrutkan dari A ke reliputi praktikum mtode PP dan SP dan diinkubasi selama 7 hari pada suhi 370C diperoleh bawha........kan kond suspensi mikroba yang terendam di dalam agar menyebabkan suplai oksigen terhadap mikroba menjadi minim dan dapat memberikan kondisi ideal bagi pertumbuhan mikroba anaerob. Sedangkan, keadaan suspensi mikroba yang terletak di atas permukaan agar menyebabkan suplai oksigen lebih optimal sehingga memberikan kondisi O₂ yang ideal bagi pertumbuhan mikroba aerob.

Ø  Penanaman Mikroba Metode Sebar (Spread Plate)

Metode sebar atau spread plate adalah salah satu metode inokulasi dengan menyebarkan suspensi mikroba di permukaan agar yang telah memadat. Pada metode ini suspensi mikroba tersebar secara merata di permukaan agar sehingga mudah dibedakan antara mikroba yang diinginkan dan kontaminan. Selain itu, suplai oksigen pada metode spread plate lebih baik daripada pour plate dimana suspensi mikroba pada media spread plate tersebar merata di atas permukaan media sehingga pertumbuhan mikroba aerob lebih baik karena ketersediaan oksigen.

Sekarang kita telah memiliki dua buah cawat petri yang telah dilakukan penanaman Rhizopus stolonifer pada media di dalamnya. Sehingga langkah selanjutnya dimasukkan ke dalam inkubator untuk diinkubasi. Inkubasi adalah proses pemeliharaan kultur media dengan temperatur dan periode tertentu sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan mikroba.

Adapun hasil inokulasi mikroba dari suspensi roti berjamur pengenceran 10^-3 yang ditanam pada media PCA melalui metode pour plate dan spread plate dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu 37˚C diperoleh bahwa koloni mikroba yang tumbuh berbentuk bulatan kecil seperti bintik-bintik, memiliki hifa, dan berwarna putih susu tersebar di permukaan media. Berdasarkan ciri tersebut diduga bahwa koloni mikroba yg tumbuh adalah Rhizopus stolonifer.